植物生長(cháng)素（IAA）在植物生長(cháng)發(fā)育過(guò)程中起著(zhù)重要的作用。其化學(xué)本質(zhì)是吲哚乙酸。主要作用是使植物細胞壁松弛，從而使細胞生長(cháng)伸長(cháng)，在許多植物中還能增加RNA和蛋白質(zhì)的合成。

目前BARLEY B RECOMBINANT/BASIC PENTACYSTEINE (BBR/BPC) 轉錄因子家族在擬南芥和水稻中已被證實(shí)能促進(jìn)誘導植物矮化(Sazuka et al. 2009; Li et al. 2008Monfared et al. 2011; Simonini et al. 2012; Petrella et al. 2020)，然而在蘋(píng)果中，BPC轉錄因子影響植物結構的確切機制尚不清楚。

2023年11月29日，西北農林科技大學(xué)園藝學(xué)院的李明軍教授課題組的研究成果，發(fā)表在The Plant cell期刊上（IF=11.6）,文章題目是“The transcription factor MdBPC2 alters apple growth and promotes dwarfing by regulating auxin biosynthesis"。該研究使用DNA親和測序（DAP-seq）技術(shù)和轉錄組測序（RNA-seq）技術(shù)鑒定及揭示了BBR/BPC家族的MdBPC2轉錄因子能夠調控蘋(píng)果生長(cháng)素生物合成，從而協(xié)調蘋(píng)果的生長(cháng)和植株結構的機制。

本研究發(fā)現MdBPC2轉錄因子在矮稈砧木中的表達高于標準砧木。MdBPC2與PcG蛋白MdLHP1a/b相互作用，負向調節生長(cháng)素的生物合成。在過(guò)表達MdBPC2的轉基因蘋(píng)果植株中，抑制MdYUC2a和MdYUC6b基因導致生長(cháng)素積累減少，植株生長(cháng)受到抑制，樹(shù)形結構發(fā)生改變。外源生長(cháng)素的補充恢復了這些轉基因蘋(píng)果植株的高度、葉片形態(tài)和根系發(fā)育。在WT植株中，抗生長(cháng)素對氯苯氧異丁酸(PCIB)處理抑制了生長(cháng)素的生物合成，導致與MdBPC2過(guò)表達轉基因蘋(píng)果植株相似的表型。最終揭示了MdBPC2如何通過(guò)H3K27me3修飾調控生長(cháng)素的生物合成以協(xié)調蘋(píng)果的生長(cháng)和植株結構的機制。

1.MdBPC2在矮稈砧木中的表達及特性研究。

作者首先在蘋(píng)果中鑒定出6個(gè)MdBPC候選基因，并在系統發(fā)育樹(shù)中分為2類(lèi)，MdBPC1與MdBPC2序列高度相似，屬于一類(lèi)。MdBPC3、MdBPC4、MdBPC5、MdBPC6屬于二類(lèi)。為確定MdBPC是否具有調控植物生長(cháng)的作用，比較了6個(gè)MdBPC基因在5個(gè)矮化砧木和5個(gè)標準砧木中的表達譜。I類(lèi)BPCs的表達水平，尤其是MdBPC2在矮稈砧木中的表達水平顯著(zhù)高于標準砧木。因此，最終選擇MdBPC2作為進(jìn)一步研究的候選基因。

利用定量PCR (qPCR)研究了MdBPC2基因在不同組織中的表達譜。結果表明，MdBPC2在整個(gè)植物中廣泛表達，其中莖尖表達量較高。為確定MdBPC2的亞細胞定位，瞬間表達了MdBPC2-GFP融合蛋白，表明了MdBPC2在細胞核中起作用。通過(guò)酵母雜交實(shí)驗，表明MdBPC2沒(méi)有轉錄激活活性，提示MdBPC2可能是一種轉錄抑制因子。利用熒光素酶(luciferase, LUC)報告系統分析了其在植物中的轉錄活性，結果表明MdBPC2具有轉錄抑制活性。

2.       過(guò)表達MdBPC2和RNAi轉基因蘋(píng)果株系的鑒定及其對植株生長(cháng)的影響。

作者構建了過(guò)表達和RNA干擾(RNAi)載體，并將其轉化為蘋(píng)果品種GL3。PCR分析得到3個(gè)過(guò)表達系(MdBPC2-OE1/3/4)和3個(gè)RNAi系(MdBPC2-RNAi3/5/6)。反轉錄定量PCR (RT-qPCR)分析顯示，與WT植株相比，轉基因MdBPC2-oe1/3/4植株的MdBPC2轉錄本約高15倍，轉基因MdBPC2-RNAi3 /5/6植株的MdBPC2轉錄本約低60%。之后還測量了MdBPC2轉基因蘋(píng)果植株中其他5個(gè)MdBPC基因的表達水平。在MdBPC2沉默系中，MdBPC1的轉錄水平也受到抑制，可能是由于序列相似性較高。在MdBPC2過(guò)表達系中，植株生長(cháng)明顯受到抑制。MdBPC2過(guò)表達顯著(zhù)降低了植株的平均株高，僅為WT植株的29%。葉片形態(tài)也發(fā)生了變化，長(cháng)寬比減小，形狀更圓。此外，過(guò)表達植株根系發(fā)育不發(fā)達，根長(cháng)縮短，側根數量減少。然而，在MDBPC2沉默系中，沒(méi)有明顯的表型變化，這可能是由于BPC家族成員之間的功能冗余。

3.       MdBPC2改變生長(cháng)素含量

植物激素調節植物的生長(cháng)發(fā)育，內源激素含量或平衡的改變可能導致植物矮化。因此，作者在轉基因過(guò)表達系和RNA沉默系中測量了生長(cháng)素(IAA)、細胞分裂素(CTK)、GA和油菜素內酯(BR)等激素含量。與WT相比，CTK、GA和BR的含量沒(méi)有變化，而MdBPC2過(guò)表達系的IAA含量顯著(zhù)降低。為進(jìn)一步確定MdBPC2-OE表型是否由IAA缺乏引起，作者用外源IAA處理了MdBPC2-OE轉基因植株，外源施用IAA能以劑量依賴(lài)的方式恢復MdBPC2-OE植株的株高、葉片發(fā)育和根系生長(cháng)。重要的是，IAA促進(jìn)了MdBPC2-OE植株的生長(cháng)，而WT植株的表型不受IAA處理的影響。這表明MdBPC2-OE植株對IAA濃度高度敏感。之后增加抑制生長(cháng)素作用的PCIB濃度處理WT植株，植株高度降低，葉片形態(tài)改變，側根數量顯著(zhù)減少，且呈劑量依賴(lài)性。結果表明，MdBPC2過(guò)表達導致內源生長(cháng)素含量降低，從而抑制轉基因植株的生長(cháng)。

4.       MdBPC2直接靶點(diǎn)的鑒定

為確定MdBPC2過(guò)表達如何改變內源IAA積累，作者使用WT和MdBPC2-OE1/3/4植株的莖尖進(jìn)行了RNA測序(RNA-seq)。鑒定出433個(gè)上調基因和587個(gè)下調基因(與WT相比)。已知參與生長(cháng)素合成和分解代謝的基因與MdBPC2-OE轉基因品系的1020個(gè)基因進(jìn)行比較，共發(fā)現3個(gè)重疊基因，分別是MdYUC2a和MdYUC6b以及MdGH3.1a，并且在3個(gè)轉基因株系中表達下調。為了驗證RNA-seq表達譜數據，通過(guò)qRT-PCR分析了這3個(gè)基因，發(fā)現表達趨勢與轉錄組數據一致，這也說(shuō)明了RNA-seq技術(shù)的準確性。

DNA親和純化測序(DAP-seq)是一種通過(guò)分析基因組DNA與體外表達的轉錄因子的結合來(lái)篩選轉錄因子結合位點(diǎn)的高通量方法。與染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP-seq)相比，具有具有不受抗體和物種限制的優(yōu)點(diǎn)，是一種高通量方法。因此，作者使用DAP-seq來(lái)揭示MdBPC2的全基因組結合位點(diǎn)，分離所有MdBPC2結合DNA進(jìn)行高通量測序分析?！?/span>GAGAGAGAGAGAG"這個(gè)富含GAGA的核苷酸序列比擬南芥BPC1結合位點(diǎn)更為保守。另外5個(gè)MdBPC2的潛在結合位點(diǎn)也高度富集。

電泳遷移率轉移試驗(EMSA)驗證DAP-seq結果的可靠性。當使用標記的富含GAGA的DNA探針時(shí)，可以檢測到特異性DNA-MdBPC2蛋白復合物，當添加缺乏生物素標記的競爭性探針時(shí)，這種信號傳導減弱。這種特異性競爭組合表明MdBPC2可以特異性識別富含GAGA的序列。結果表明，MdBPC2在轉錄水平上通過(guò)抑制MdYUC2a和MdYUC6b抑制生長(cháng)素的生物合成。

5.       MdBPC2抑制MdYUC2a和MdYUC6b的轉錄

為確定MdBPC2是否直接影響MdYUC2a和MdYUC6b的轉錄激活，作者在蘋(píng)果愈傷組織中瞬時(shí)表達系統中檢測了ProMdYUC2a:LUC和ProMdYUC6b:LUC構建體的生物發(fā)光信號，結果表明，MdYUC2a和MdYUC6b啟動(dòng)子區域中所有富GA元件都可以與MdBPC2蛋白結合。

ChIP-qPCR結果表明MdBPC2可以通過(guò)GA-富元件與MdYUC2a和MdYUC6b啟動(dòng)子結合。這些結果表明，生長(cháng)素生物合成的關(guān)鍵基因MdYUC2a和MdYUC6b是MdBPC2的直接轉錄靶點(diǎn)，其轉錄活性受到MdBPC2的抑制。

6.       MdBPC2介導抑制組蛋白三甲基化在H3K27位點(diǎn)的富集

翻譯后組蛋白修飾與基因轉錄的激活或抑制有關(guān)。組蛋白3賴(lài)氨酸27三甲基化(H3K27me3)的全基因組研究發(fā)現，表觀(guān)遺傳機制可以調節生長(cháng)素相關(guān)基因。為檢測H3K27me3抑制標記是否與MdBPC2對MdYUC2a和MdYUC6b的抑制有關(guān)，通過(guò)ChIP檢測MdBPC2過(guò)表達后H3K27me3抑制標記在MdYUC2a和MdYUC6b位點(diǎn)的潛在差異，結果表明MdBPC2在抑制MdYUC2a和MdYUC6b表達的表觀(guān)遺傳修飾中起重要作用。

7.       BPC2蛋白與PcG亞基LHP1a/b物理相互作用

在植物中，抑制表觀(guān)遺傳修飾H3K27me3主要由PcG蛋白識別和催化。作者使用酵母雙雜交(Y2H)實(shí)驗來(lái)測試MdBPC2與抑制性表觀(guān)遺傳修飾相關(guān)蛋白的相互作用，包括MEDEDA (MEA)、CURLY (CLF)、SWINGER (SWN)、胚胎花2 (EMF2)、受精獨立胚乳(FIE)和LIKE異染色質(zhì)蛋白1 (LHP1)。研究結果表明，MdBPC2與MdLHP1a/b相互作用。通過(guò)雙分子熒光互補(BiFC)進(jìn)一步評估。通過(guò)共表達融合蛋白nYFP-LHP1a/b和cYFP-BPC2，能在煙草表皮細胞細胞核中重建YFP的活性，證明MdLHP1a/b與MdBPC2相互作用。這些結果表明，MdBPC2可以通過(guò)MdLHP1a/b募集PcG復合物到靶基因。

8.       LHP1參與MdBPC2介導的YUC2a/6b表達抑制

由于MdBPC2可以特異性結合GAGA序列，并且MdBPC2和MdLHP1之間存在相互作用，作者假設MdLHP1在MdBPC2誘導的MdYUC2a和MdYUC6b表達抑制中起作用。為驗證這一假設，首先使用ChIP-qPCR檢測了MdYUC2a和MdYUC6b位點(diǎn)富集的MdLHP1水平，結果顯示MdYUC2a和MdYUC6b位點(diǎn)H3K27me3水平的變化是由MdLHP1引起的。

為驗證MdLHP1在MdYUC2a和MdYUC6b啟動(dòng)子上的富集是否需要MdBPC2的結合，制作了4個(gè)轉基因蘋(píng)果愈傷組織系，含有突變的富GA元素的轉基因品系與含有完整的富GA元素的轉基因品系相比，H3K27me3水平顯著(zhù)降低。這些結果表明，靶啟動(dòng)子內的MdBPC2結合位點(diǎn)對于MdLHP1介導的H3K27me3修飾是必需的。

9.       MdLHP1調控生長(cháng)素生物合成基因

為證實(shí)MdLHP1參與了MdBPC2對生長(cháng)素水平的調節在蘋(píng)果愈傷組織中過(guò)表達MdBPC2，獲得了3個(gè)轉基因系MdBPC2-GFP-OE1/2/3。這些轉基因系的愈傷組織中MdYUC2a和MdYUC6b的表達水平顯著(zhù)降低，與轉基因植物中的觀(guān)察結果一致。

DR5是一種合成的生長(cháng)素反應元件，含有許多ARF轉錄因子的結合位點(diǎn)。因此，在DR5啟動(dòng)子控制下表達的報告基因活性可以反映植物內源生長(cháng)素含量。利用合成的ProDR5:GUS構建體分析了轉基因蘋(píng)果愈傷組織MdBPC2-GFP-OE1/2/3的生長(cháng)素含量。如圖E所示，與WT相比，MdBPC2-GFP-OE1/2/3的GUS染色明顯降低。當沉默MdLHP1時(shí)，GUS活性恢復并且高于WT。綜上所述，這些數據表明MdLHP1參與了MdBPC2在生長(cháng)發(fā)育過(guò)程中對生長(cháng)素生物合成的調節。

小結

株高是農作物和園藝作物最重要的農藝性狀之一。它限制了植物各器官的空間排列，與產(chǎn)量和品質(zhì)密切相關(guān)。植物高度受環(huán)境、植物激素代謝和信號通路的相互作用控制，轉錄因子在這些過(guò)程中發(fā)揮重要作用。雖然轉錄因子在植物高度調節中的重要性早已被提出，但它們如何調節植物矮化的潛在分子機制卻知之甚少。在本研究中，作者發(fā)現MdBPC2調控MdYUC2a和MdYUC6b的轉錄，抑制生長(cháng)素的生物合成，從而調節植物結構。揭示了多年生木本植物通過(guò)BPC轉錄因子調控生長(cháng)素合成的新機制，為優(yōu)化植物結構和提高產(chǎn)量提供了新的思路。